Pferd und Reiter Blog

Oktober 26, 2010

Dopingrelevanz beim Pferd

Doping ist ein Gebiet mit vielen Facetten. Aufgrund des komplexen Themas gibt es viele Ansätze Doping zu definieren und zu klassifizieren. So regeln die verschiedenen  Pferdesportverbände in ihren Dopingbestimmungen, was unter den Bereich des Dopings fällt. Doch es gibt eine Grundaussage: Doping ist ethisch verwerflich und
rechtlich verboten.

Als Dopingfall wird die nachgewiesene Anwendung von Substanzen, die auf der Dopingliste stehen oder verwandte Substanzen definiert. Ausgenommen sind einige wenige Therapeutika, für die Grenzwerte bestehen oder ausgenommen sind.
Mit Tetrahydrogestrinon (THG) wurde eine Substanz für Dopingzwecke
gezielt hergestellt, die keine Zulassung als hatte oder je bekommen sollte. Ziel war es  einen Stoff zu synthetisieren, der in Dopingnachweisverfahren schwer detektierbar ist. Mit Tetrahydrogestrinon wurde das erste Designersteroid (THEWIS, 2005) entwickelt.

Es wurden in der Masse so verändert, dass ein Nachweis mit bekannten Verfahren nicht mehr möglich war. Ziel war es nun, eine geeignete Nachweismethode für THG im Plasma und Urin zu entwickeln und so klinisch nachzuweisen.

Doping wird bei Pferden angewandt, mit dem Ziel einer Beeinflussung der natürlichen und aktuellen Leistungsfähigkeit bei sportlichen Wettkämpfen.
Zur Geschichte: Im Jahre 1899 stand der Begriff des Doping erstmals in einem englischen Wörterbuch, womit ein Gemisch aus Opium und Narkotika zur Verabreichung an Pferdebezeichnet wurde (HERMLE, 1996). Damit hatte sich das Wort Doping im internationalen Sprachgebrauch als Begriff für die missbräuchliche Einnahme von Mitteln zur Leistungssteigerung durchgesetzt.

Doch schon in der Antike war der Gebrauch von leistungssteigernden Mitteln bekannt. Aus dem alten Rom ist bekannt, dass eine als „Hydromel“ bezeichnete wässrige
Honiglösung zur Verbesserung der Geschwindigkeit und Ausdauer bei Rennpferden
verabreicht wurde (MORGAN, 1957), was mit der Todesstrafe geahndet wurde.

Erste Dopingkontrollen ordnete der Australische Jockey Klub 1910 an und die ersten Dopingreglementierungen wurden am 14. Juni 1666 in England verabschiedet.

Pferden wurden also schon Mittel verabreicht, bevor sich Menschen Dopingsubstanzen zu eigen machten. Aber auch in jüngerer Vergangenheit bis heute ist Doping im Pferdesport ein internationales Problem.

Heute wird jedoch oft ausgeführt, dass es „der Sinn aller FEI-Wettkämpfe ist, die Talente von Pferden und Reitern im Vergleich unter gleichen Bedingungen und auf der Grundlage ihrer Fähigkeiten durchzuführen. Der Gebrauch von verbotenen Substanzen kann die Leistung beeinflussen oder ein vorliegendes Gesundheitsproblem überdecken und zusätzlich das Ergebnis eines Wettkampfes verfälschen.
Die Dopingbestimmungen im Pferdesport dienen vor allem dazu, dem Tier bzw. dem
Tierschutz zu dienen. Grundlage hierfür ist § 3 des Tierschutzgesetzes. Die
Dopingreglementarien im Humanbereich basieren hingegen auf dem
Arzneimittelgesetz (AMG §6). In Deutschland wird die Verabreichung von Substanzen über die Leistungsprüfungsordnungen der drei großen deutschen Pferdesportverbände,
Deutsche Reiterliche Vereinigung e. V. [FN], Direktorium für Vollblutzucht und
Rennen e. V. [DVR] und Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e. V. [HVT]
geregelt.
Besonders seitens der FN wird eine möglichst große Übereinstimmung mit den Bestimmungen der FEI angestrebt, aber auch DVR und HVT stimmen hinsichtlich des generellen Verbots jeglicher körperfremder Substanzen mit der FN überein.

So gibt es heutzutage Medikationskontrollen, Verfassungsprüfungen und Pferdekontrolle, wobei sich die “Tierärzte”  an detaillierte Anweisungen zum Ablauf in der Durchführung der Tests halten müssen.

Es wird zwischen„Punkt 1 Dopingsubstanzen“ und „Punkt 2 Verbotene Arzneimittel“ unterschieden, sowie unter Punkt 3 die Ausnahmen hiervon geregelt.
Hierbei werden Dopingsubstanzen als Substanzen bezeichnet, die geeignet sind, die
Leistung eines Pferdes/Ponys im Wettkampf zu beeinflussen. Dabei werden nicht
einzelne Arzneimittel, sondern Stoffgruppen wie zum Beispiel Sedativa und
Narkotika, Stimulantien, Diuretika oder Anabolika aufgeführt.
Ausnahmen von oben genannten Bestimmungen bilden Substanzen zur Pflege und
Vorbeugung wie zum Beispiel Impfstoffe, die bis spätestens 14 Tage vor der Prüfung
appliziert werden, oder Insektenschutzmittel.
Entgegen der LPO oder RO werden beim Rennsport keine Grenzwerte für einzelne Mittel angegeben, so dass jeglicher Nachweis verbotener Stoffe positiv berichtet wird.

Die Auswahl der Pferde, von denen Urin oder Blut auf das Vorhandensein verbotener Substanzen untersucht wird, erfolgt nach dem Zufallsprinzip und aufgrund von Verdachtsfällen.
Die Zahl der Positiv gesteten Proben der FN schwankte von 2000 bis 2004 zwischen 0,88% und 2,01% (Mittelwert: 1,324%), wobei im Durchschnitt 1544,2 Proben von der FN getestet wurden.

Die für die Arbeit interessante Gruppe sind die Sexualhormone. Eine Einteilung der Sexualhormone erfolgt in drei Klassen. Die männlichen Sexualhormone werden als
Androgene, die weiblichen als Gestagene und Östrogene bezeichnet.
Estrogene sind Abkömmlinge des C18- Grundgerüst Estran und besitzen einen
aromatischen A-Ring. Die körpereigenen Estrogene sind Estradiol, Estron und
Estriol. Sie werden in den Granulosazellen der Ovarfollikel, in der Plazenta, in den
Nebennierenrinden und in den Hoden gebildet. Sie können aber auch durch
Aromatisierung von Androgenen im Fettgewebe entstehen.

Bei Verabreichung rufen sie beim weiblichen Tier Brunstsymptome hervor. Östrogen wirksame Stoffe gibt es auch pflanzlichen Ursprungs: die Phytoöstrogene. Sie haben auch die Östrogene Wirkung inne.
Gestagene, das natürliche Progesteron und synthetische Derivate, teilen sich, ihrer
chemischen Struktur nach in zwei Gruppen ein. Die Struktur von C21-Gestagenen,
die sich vom Progesteron ableiten, und die Gestagene, die sich von 19-Nor-
Testosteron ableiten. Sie sind für die Implantation und Entwicklung des Embryos
verantwortlich. Die Bildung findet speziesabhängig im Corpus luteum und in der
Plazenta statt. Ihre Wirkung beruht hauptsächlich in dem Zusammenwirken mit
Östrogenen.

Bei den Androgenen ist Testosteron das wichtigste im Körper gebildete Hormon. Es
ist ein C19-Steroid und stammt zum überwiegendem Teil aus den Leydig´schen
Zwischenzellen des Hoden. Den Rest produziert die Nebennierenrinde. Weitere im Organismus produzierte Androgene sind Androstendion und Dehydroepiandrosteron.
Sie sind etwa 5 – 10-fach geringer wirksam wie Testosteron.
Die Wirkungen sind wie folgt zusammenzufassen: Entwicklung und Funktion der männlichen Geschlechtsorgane, Regulation der Spermienproduktion, Förderung des
Eiweißaufbaus und Hemmung der Gonadotropinfreisetzung (LÖSCHER, 2002).

Anabolika im engeren Sinne sind synthetische Abkömmlinge der Androgene, die eine
stärkere anabole Wirkung als androgene Wirkung hat. Sie leiten sich zum größten
Teil vom 19-Nor-Testosteron ab, aber auch andere Modifikationen des Steroidgerüstes führen zu Hormonen mit anabolen Effekten. Im weiteren Sinne zählen auch die körpereigene Stoffe, wie vor allem Testosteron dazu (SCHÄNZER,1997).

Eine entscheidende Frage bei dem Einsatz dieser Stoffe ist die Wirksamkeit. Hierfür hat sich der Herschberg-Test durchgesetzt. Hierbei erfolgt die
biologische Überprüfung von Androgenen und Anabolika an infantilen, kastrierten
männlichen Ratten. Es werden die Massenzunahmen von Samenblase, Prostata und
musculus levator ani überprüft. Als Ausdruck der androgenen Komponente gilt die
Zunahme von Samenblase und Prostata, als Maß für die Anabolität die
Massenzunahme des musculus levator ani.
Nebenwirkungen von Anabolika treten hauptsächlich bei längerfristiger Einnahme
auf. Eine Veränderung des Blutbildes und des Blutdruckes kann jedoch schon bei
einmaliger Einnahme festgestellt werden. Bei einigen Präparaten kommt es zu
Herzrhythmusstörungen, starkem Schwitzen und Muskelzittern. Nach längerfristigem
Konsum von Sterioden kann es zu einer psychischen und physischen Abhängigkeit
kommen. Es können starke Stimmungsschwankungen, aggressive Tendenzen,
Depressionen und psychotische Phasen auftreten.

Weiter haben sie einen starken Einfluss auf die Sexualität und die Geschlechtsmerkmale. So führt die Einnahme von anabolen Sterioden beim Mann zu einer gestörten
Spermienproduktion, zu einer Atrophie der Hoden bis hin zur Unfruchtbarkeit. Bei
Frauen können anabole Steroide eine Veränderung des Menstruationszyklus, eine
Vergrößerung der Klitoris, starker Körperbehaarung und Bartwuchs, als auch einer
tiefen Stimme führen (DUCHAINE, 1989).

Neben der langen Geschichte des Dopings, ist auch der Missbrauch von
Steroidhormonen seit einiger Zeit bekannt. Seit den 60er Jahren wurde diese
Handhabung vom Internationalen Olympischen Komitee beobachtet, konnte aber erst
1974 verboten werden, da bis zu diesem Zeitpunkt kein ausreichend sicheres
Verfahren zum Nachweis zur Verfügung stand.Ab diesem Zeitpunkt war die
Anwendung von exogenen anabolen Steroiden verboten. Erste Kontrollen erfolgten
bei Wettkämpfen ab 1976 (SCHÄNZER, 1997).

Die Entwicklung ab den 60er Jahren zeigt eine Entwicklung ganz deutlich: den
Wettlauf zwischen Doping und dessen Nachweis.
Herstellung
Ausgangsmaterial für die Herstellung von Tetrahydrogestrinon (THG) ist Gestrinon. Gestrinon hat unter dem Handelsnamen *** eine Zulassung in der Schweiz zur Endometriosebehandlung der Frau. Gestrinon ist ein 19-Nor-Steroid und wurde
ursprünglich zur oralen Empfangnisverhütung hergestellt. Es wirkt androgen,
antiöstrogen und antigestagen. Eine anabole Wirkung wird vermutet. Das internationale Olympische Komitee hat Gestrinon deshalb auf die Liste der
verbotenen Substanzen gesetzt.

Wirkung
Die Wirkung von THG ist in zwei verschiedenen Systemen kontrolliert worden. Eine
Australische Arbeitsgruppe hat die Wirkung von THG an einer Hefezelllinie überprüft
(DEATH et al, 2004). Hierfür bauten sie in eine Hefezelllinie Androgen-, Progesteronund
Östrogenrezeptoren ein und überprüften die Bindung und Wirkung von THG.
THG zeigte in dieser Studie auch Aktivität am Progesteron-Rezeptor. Diese Aktivität übertraf neben der Wirkung Gestrinon und Trenbolon, sogar die des Progesterons. Zusammenfassend ist zu sagen, dass THG in dieser Studie ein hochpotenter androgen und gestagen wirksamer Stoff ist. Es hat keine Wirkung auf den Östrogenrezeptor gezeigt.
Zu den zu erwartenden Nebenwirkungen sollen beim Mann reduzierte
Spermiogenese, Hodenatrophie und Unfruchtbarkeit zählen. Bei der Frau seien
Vermännlichung, Stimmbruch und Zyklusstörungen zu erwarten.
LABRIE et al (2004) hat die Wirkung von THG am lebenden Organismus getestet.
Für diese Studie wurden 11-12 Wochen alte männliche Mäuse genommen und kastriert.  Jede Gruppe hatte eine Größe von 10 Tieren. Sieben
Tage nach der Kastration wurden die Gruppen mit 0,1 mg oder 0,5 mg
Dihydrotestosteron bzw. THG pro Tier sub cutan behandelt. Die Mäuse wurden
anschließend unter Isoflurannarkose euthanasiert. Von den euthanasierten Tieren
wurden die Prostata, die Samenblase, sowie die M. gastrocnemius and M. levator ani
gewonnen.
Bei der Rezeptoraffinität zeigte THG eine die stärksten Bindungseigenschaften an
den Androgenrezeptor. Die relative Bindungsfähigkeit von Dihydrotestosteron,
Testosteron und Methyltrienolon gegenüber THG betrugen 72, 58 bzw. 7 %. Bei der kastrierten Kontrollgruppe ging das Muskelgewicht um 26% zurück, wobei die
Ursprungsmasse bei der Gabe beider Substanzen unverändert blieb.
Zur Untersuchung der Eliminationskinetik von Tetrahydrogestrinon (THG) im
Pferdeblut und -urin wurde die Substanz einmalig in einer Dosis von 0,025 μg/kg KM
oral appliziert. Die Dosis ist angelehnt an die therapeutische Dosis von Gestrinon,.
Die Studie teilte sich in einen Vorversuch und in einen Hauptversuch. Im Vorversuch
erfolgte an Blut- und Urinproben eines Pferdes die Entwicklung und Validierung der
Analysemethode. Im Hauptversuch wurde THG 10 Pferden appliziert. Während der
Dauer der Versuche wurden den Pferden in festgelegten Zeitabständen Blutproben
entnommen. Ebenfalls zeitlich kontrolliert wurde Spontanurin aufgefangen.
Die Plasma– und Urinproben wurden im Institut für Biochemie der Deutschen
Sporthochschule Köln aufgearbeitet und die Ergebnisse pharmakokinetischen Berechnungen unterzogen.

Für die Versuche wurde eine Gruppe von 10 Wallachen im Alter von 5 bis 9 Jahren
verwendet. Es handelte sich dabei um 8 Warmblutpferde und 2 Vollblüter. Ihr
mittleres Gewicht betrug 591 kg. Pferd 2 wurde sowohl im Vorversuch als auch im
Hauptversuch eingesetzt, wobei zwischen diesen Versuchen ein zeitlicher Abstand
von 4 Monaten lag.

Die Pferde waren im Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für Landwirtschaft
(FAL) in Mariensee in einem festen Herdenverband untergebracht. Die Gruppe
wurde in einem Laufstall auf Stroh mit unbegrenztem Zugang auf ein Paddock sowie
täglichem Weidegang gehalten.
Morgens bekamen alle Tiere Hafer und Mineralfutter in Einzelfressständen. Die Menge der Ration richtete sich nach dem Ernährungs- und Trainingszustand des einzelnen Tieres. Tagsüber hatten alle Pferde Zugang zu Grassilage und Wasser.
Alle Tiere waren entwurmt und gegen Tetanus, Equines Herpesvirus und Influenza
geimpft.

Vor Versuchsbeginn wurden die Pferde einer klinischen Allgemeinuntersuchung unterzogen. Zusätzlich wurden der Ernährungszustand, das Temperament und der klinische Gesamteindruck beurteilt. Alle Tiere waren klinisch unauffällig. Um zu gewährleisten, dass es nicht zu Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten kommt, wurde sichergestellt, dass den Tieren ab 4 Wochen vor Studienbeginn keine Medikamente mehr verabreicht worden waren.

Im Zuge der Vorbereitung auf die Studie wurden alle Pferde darauf konditioniert, kurz
nach dem Betreten des mit Stroh eingestreuten Laufstalles Spontanurin abzusetzen.
Dabei macht man sich das Phänomen zunutze, dass Pferde meist spontan „stallen“,
sobald sie sich in mit Stroh eingestreuten Boxen befinden. Um dieses Verhalten zu
verstärken, wurden die Tiere zuerst über mehrere Stunden ausgesperrt, dann in den
Laufstall gelassen und für das Absetzen von Urin mit Futter belohnt.
Im Laufe derKonditionierung konnten die Tiere so trainiert werden, dass ein Urinabsatz zeitgenau standfinden kann. Vor Beginn der Versuche wurde das Gewicht der Tiere mittels einer Zurich Viehwaage (Messbereich bis 2000 kg) ermittelt.

Durch den Pferden wurde dann eine Blutprobe von45 ml entnommen. Zusätzlich wurde Spontanurin wurde aufgefangen. Beide Proben dienten als Nullproben, der einzelnden Pferde.

Es wurde, umgerechnet auf das metabolische Körpergewicht des Pferdes, eine Dosierung von 0,025 mg/kg KM verabreicht. Die Applikation von THG erfolgte oral. Hierbei wurde die Substanz tief auf den Zungengrund oral eingebracht und das Abschlucken überprüft.

Für die Gewinnung von Spontanurin wurden die Pferde von der Stallgasse oder dem
Paddock mit Einzelhaltung in den Laufstall geführt. Für das Auffangen des Urins wurde eine Kunststoffhalterung verwendet, die an einem etwa ein Meter langen Stiel befestigt war und in die für jede Probe ein Einmalplastikbecher eingesetzt wurde. Dadurch konnte eine Kontamination der Proben verhindert werden.
THG liegt im Körper überwiegend nicht frei vor. Ein Nachweis mittels LC/MS/MS
erfasst aber nur freies THG. Um die Gesamtfraktion von THG nachzuweisen, ist eine
Aufarbeitung nötig. Hierbei werden Sulfate und Glucuronide, die an THG gebunden
sind, abgespalten und die Gesamtfraktion frei. Um diese Arbeitsschritte  zu überprüfen, wurde bei der Aufarbeitung im Urin, ein Standardgemisch aus Nortestoronglucuronidat und D4-Androsteronsulfat zugegeben.

Die Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) stellt den niedrigsten
Messwert einer zu analysierenden Substanz dar, welche ein Instrumentensignal
erzeugt, das sich vom Leerwert unterscheidet.
Die Ermittlung der Nachweisgrenzen erfolgte anhand der Kalibrierkurvenmethode
nach DIN 32645.

Die Konzentrationen von THG im Plasma betrugen 2,5 / 5 / 10 ng/ml. Die Urinkonzentrationen lagen bei 10 /30 / 50 ng/ml.

Um die Spezifität der Methode für THG und Gestrinon zu überprüfen, wurden
Plasma- und Urinproben, denen die Substanzen zugesetzt waren, untersucht. Dabei
konnte festgestellt werden, dass die Analyten ohne Verfälschung durch
Matrixinhaltsstoffe (Spezifität) und ohne gegenseitige Störungen bei ausreichender
Trennung (Selektivität) erfasst werden. Unter den Messbedingungen waren die
Retentionszeiten über den gesamten Verlauf der Studie in einer Schwankungsbreite
von ≤ 2 % konstant.

Zur Überprüfung der Aufarbeitungsprozedur Urin wurde die Abspaltung der
Konjugate von Nortestoteronglucuronidat und D4-Androsteronsulfat überprüft. Diese
Überprüfung erfolgte optisch anhand der Auswertung der Signale. Bei allen
ausgewerteten Proben war ein reproduzierbares, deutliches Signal zu erkennen.

Ein Nachweis war bei 2 Pferden nach 6, bei weiteren 3 Pferden nach 8, und bei 5 Pferden nach 12 Stunden noch nachweisbar. Nach 24 Stunden waren alle Pferde unterhalb der Nachweisgrenze.

Bei den maximalen Konzentrationen war ein Nachweis bei 8 Pferden nach 24 und bei weiteren 2 Pferden nach 36 Stunden noch möglich. Nach 48 Stunden waren alle Pferde
unterhalb der Nachweisgrenze.

Ein Nachweis von THG im Plasma war bei allen Pferden möglich. Der Nachweis war bei 2 Pferden über 6 Stunden, bei 3 Pferden über 8 Stunden und bei den restlichen 5 Pferden über 12 Stunden möglich.
Die interindividuellen Unterschiede in der Ausscheidungszeit machen deutlich, dass
die Beurteilung des Ausscheidungsverhaltens einer Substanz anhand ihrer
Konzentration im Urin mit erheblichen Unsicherheiten verbunden ist. Hierfür ist vor
allem die unterschiedliche Harnproduktion der einzelnen Individuen verantwortlich zu
machen.
Eine illegale Verwendung von THG als Dopingmittel ist aufgrund der einfachen
Herstellung und der Verwendung dieser Substanz im Humanbereich durchaus
denkbar. Mit dieser Arbeit wurde eine geeignete Analysemethode für den Nachweis
von THG in Plasma und Urin entwickelt und validiert.
Bei der hier durchgeführten Studie sind die Nachweiszeiten als sehr kurz einzustufen. So war bei keinem der Pferde ein Urinnachweis von THG nach 2 Tagen möglich.
Da so kurze Nachweiszeiten es ermöglichen, bis kurz vor einem Wettkampf ein Präparat zu verabreichen, dem zum Wettkampfzeitpunkt sehr wohl noch eine Wirkung zugerechnet werden muss, die Substanz selber aber nicht mehr nachweisbar ist.
Da THG keine Zulassung als Medikament besitzt, sondern gezielt zu Dopingzwecken synthetesiert wird, ist jeder positive Befund als Doping zu bewerten und eine verbotene Medikation ist auszuschließen. Dies ist unabhängig von der nachgewiesenen Konzentration.

TiHo Hannover

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